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在ELISA試劑盒中通常有3次加樣步聚，即加標本，加酶聯絡物，加底物。加樣時應將所加物加在ELISA試劑盒板孔的底部，避免加在孔壁上部，并留心不可濺起，不可發生氣泡。
加標本通常用微量加樣器，按規矩的量參與板孔中。每次加標本應更換吸嘴，避免發生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加樣。
有此測定（如間接法ELISA）需用稀釋的血清，可在試管中按規矩的稀釋度稀釋后再加樣。也可在板孔中參與稀釋液，再在其間參與血清標本，然后在微型轟動器上轟動1分鐘以確保混和。加酶聯絡物使用液和底物使用液時可用定量多道加液器，使加液進程靈敏結束。在ELISA試劑盒中通常有兩次抗原抗體反應，即加標本和加酶聯絡物后。抗原抗體反應的結束需要有一定的溫度和時間，這一保溫進程稱為溫育（incubation），有人稱之為孵育，在ELISA查看試劑盒中似不恰當。
ELISA試劑盒屬固相免疫測定，抗原、抗體的聯絡只在固相表面上發生。以抗體包被的夾心法為例，參與板孔中的標本，其間的抗原并不是都有對等的和固相抗聯絡的機遇，只需zui靠近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個逐，因此需經分散
才能到達反應的結束。在這以后參與的酶符號抗體與固相抗原的聯絡也相同如此。這便是為何ELISA查看試劑盒反應老是需要一定時間的溫育。
溫育常選用的溫度有43℃、37℃、室溫文4℃（冰箱溫度）等。37℃是試驗室中常用的保溫溫度，也是大多數抗原抗體聯絡的適合溫度。在樹立ELISA方法作反應動力學研究時，試驗標明，兩次抗原抗體反應通常在37℃經1-2小時，產物的生成可達。為加速反應，可提高反應的溫度，有些試驗在43℃進行，但不宜選用更高的溫度。抗原抗體反應4℃更為*，在放射免疫測定中多使反應在冰箱中，以形成zui多的堆積。但因所需時間太長，在ELISA試劑盒中通常不予選用。
ELISA試劑盒的質量凹凸要素取決于這兩個方面
  1.選材目標。
  2.選材進程。
胎牛血清用于選材的胎牛應健康無病并且在的出生天數以內，選材進程應嚴峻按照操作規程實行，制備出的血清要經過嚴峻的質量判定。分外懇求有：
  a.要經過濾膜過濾除菌，確保無菌；
  b.證明所用血清中不含對所出產疫苗病毒的按捺物；
  c.無細菌、霉菌、支原體和病毒的污染，有些國家懇求無細菌噬菌體污染；
  d.對細胞有出色的支持繁衍作用；
  e.有必要來自有文件證明無牛海綿狀腦病的牛群或國家。并應具有恰當的監測系統。